【Part1 引言】

01 背景简介

内源细胞较少的组织缺乏恢复其完整机械强度和功能的内在能力，因此造成了相关病症的临床问题和医疗负担，因此基于干细胞的疗法为治疗各种组织损伤给予了巨大的临床前景。

肌腱干细胞(TSPCs)是在肌腱中发现的一种特殊干细胞群，不仅具有多能性和自我更新能力，而且还具有成腱表型，是肌腱再生的理想种子细胞。

02 面临的瓶颈：2D传统细胞培养模式

扩大足够数量的TSPCs用于临床治疗，同时保留其干性和成腱表型仍然是一个重大挑战：常用的二维单层培养TSPCs的条件不能模仿三维生理条件，这可能导致肌腱相关基因的表达丧失，导致再生能力下降。此外，二维培养皿生长表面很小，因此不可能安全、经济地生产干细胞，也不可能有足够的规模来满足未来基于干细胞的临床治疗的细胞剂量要求。

03 解决的方法：3D微环境细胞培养模式

为了更好地再现干细胞培养体内微环境的关键特征和功能，3D微环境已受到相当大的关注。3D微环境是一种新颖的干细胞培养方法，因为它们体积小但表面积大，而且易于操作。此外，与传统的二维微环境相比，给予了仿生的微环境，以形成充分的细胞-细胞和细胞-ECM相互作用的细胞培养。

【Part2 文献解读】

在本期所描述的文献中，研究者顺利获得使用Ezpay生物3D明胶微载体培养系统培养了人类肌腱干细胞（hTSPCs），发现3D明胶微载体培养体系培养的hTSPCs在体内外均表现出了卓越的干细胞特性和功能，明显优于传统2D方式培养的hTSPCs，进一步探索了相关机制。

01 材料与方法

研究者使用来自Ezpay生物的3D TableTrix® 微载体作为细胞培养的3D微环境进行细胞培养，进一步作者对3D微环境扩增的细胞进行了细胞活力与增殖能力评估、分化能力评估、流式表型分析、免疫荧光染色、转录组分析，此外研究者还进行了动物实验，对体内形成的肌腱进行了一系列表征。

02 实验结果

3D微载体为hTSPC培养给予了一个优秀的平台

图1：细胞增殖倍数曲线以及活死染色荧光图像

3D组的hTSPCs更倾向于年轻干细胞而不是衰老干细胞：免疫荧光染色显示，与2D组相比，3D组的hTSPCs具有较少的扩散形态，表现为细胞面积和体积明显较小，核质比和球形度明显改善。

图2：免疫荧光染色后hTSPCs的3D共聚焦图像

图3：培养4天后，hTSPCs 2D及3D培养细胞的细胞体积（左）和核质比（右）

图4：培养4天后，hTSPCs 2D及3D培养细胞的细胞面积（左）和球形度（右）

3D微载体扩增的hTSPCs表现了更好的成腱分化能力

● 增强了成肌腱相关的基因表达，标志物含量相对2D培养方式增加。

 免疫荧光染色法证明，3D组中肌腱特异性标志物的表达明显提高。

图5：肌腱诱导7 天，TNMD、COL1和COL14的免疫荧光染色

肌腱相关基因的表达在3D微环境中明显更高。

图6：培养4天后，对hTSPCs的SCX、FOS、DCN和TNMD进行qRT-PCR分析

● 3D培养的hTSPCs新细胞群结构有助于增强其成腱能力。

研究者比较了3D组和2D组中每个亚群的比例。虽然CKS2+CENPF+亚群在2D组明显富集，但其他集群在3D组更丰富，其中ICAM1+ITGB8+FGF7+和FGF7+CYGB+亚群在3D组占优势。在ICAM1+ITGB8+FGF7+和FGF7+CYGB+亚群中，肌腱相关基因的表达增加，但在CKS2+CENPF+亚群中，这一表达较低。

图7：UMAP图hTSPCs分成五个亚群（左）以及其占比柱状图（右）

图8：相关基因表达的点阵图及小提琴图

● 3D微环境激活的FGF7信号，顺利获得细胞间相互作用提高了其成腱能力。

研究者发现3D微环境顺利获得激活FGF7来增强成腱表型。整合素介导的FGF7旁路调节ICAM1+ITGB8+FGF7+和FGF7+CYGB+亚群中的ERK MAPK/PI3K/STAT信号，从而顺利获得细胞-细胞间的相互作用增强了3D微环境中hTSPCs的成纤维表型。

图9：整合素-FGF7-ERK MAPK/PI3K/STAT信号转导有关的基因表达情况（左），ICAM1+ITGB8+FGF7+亚群中整合素-FGF7-ERK MAPK/PI3K/STAT信号基因交互网络（右）

3D微载体扩增的hTSPCs有更优秀的体内肌腱形成能力

研究者进行了动物实验，在术后两周和四周进行了相关表征检测。

图10：动物实验示意图

术后两周后

3D组在修复部位表现出密集且排列整齐的再生肌腱，宏观形态上几乎没有炎症和肿胀，2D组&对照组则表现出松散、排列不整齐的软组织，有圆形的细胞和一些血管，有明显的炎症和肿胀。3D组比2D组和对照组的胶原纤维更大、更整齐。

图11：术后两周修复的大鼠髌骨肌腱的H&E、Masson和偏振光的代表图像

图12：术后两周肌腱组织内胶原纤维的横截面与纵截面的TEM图像

图13：术后两周肌腱组织内胶原纤维的平均直径以及分布

图14：术后两周内胶原纤维方向的角度分布

术后四周后

与两周时的肌腱相比，3D组的修复肌腱更加致密，有更多的纺锤形细胞沿拉伸负荷轴线分布，宏观形态上炎症较少，2D组对照组的再生肌腱则充满了多细胞和杂乱的胶原纤维，有一些炎症和肿胀。

图15：术后四周修复的肌腱的代表性H&E、Masson和偏振光图像

在核磁共振（MRI） T2加权图像中，三维组的再生肌腱表现出低强度、均匀的信号和清晰的边缘，与健康肌腱相似；而二维组和对照组的再生肌腱则表现出不规则的轮廓和异质的高强度信号，表明这两组的损伤和炎症仍然存在。

图16：修复后的髌骨肌腱的T2加权MRI扫描及其半定量数据MRI图像（A），高或中等强度信号区（AHS）和总纵向区域（AT）的比率分析（B，D）以及腱内病变的强度（C，E）。红色箭头表示肌腱区域。

与二维和对照组相比，三维组具有更好的生物力学性能。3D组的刚度、破坏时的应力和破坏力都明显高于其他组。三维、二维和对照组的模块分别为正常大鼠髌腱的42.74%、14.05%和14.24%。三维组破坏时吸收的能量分别比二维组和对照组高2.53倍和3.06倍。二维组和对照组的机械性能没有明显差异。

图17：术后四周再生的髌骨肌腱的机械性能：刚度 | 破坏时的应力 | 破坏时吸收的能量 | 破坏力 | 模量 

03 结论

本研究顺利获得hTSPCs的3D微环境培养发现3D微环境调控干细胞功能的相关机制，关键细胞亚群的改变和FGF7的激活对于提高hTSPCs的成腱能力至关重要。

3D TableTrix® 微载体作为3D微环境生产的hTSPCs有更好的细胞活率，增殖倍数，细胞也更年轻，且有更强的干性，体内实验也表现出了更优秀的生物学有效性。

参考文献：

Hong Zhang, Yangwu Chen, Chunmei Fan, et al. Cell-subpopulation alteration and FGF7 activation regulate the function of tendon stem/progenitor cells in 3D microenvironment revealed by single-cell analysis. Biomaterials. 2022 Jan;280:121238.

图片来源：

文中所附研究说明相关图表，均来自文献原文。

原文链接：

10.1016/j.biomaterials.2021.121238

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